猪流行性腹泻病毒变异株XP2018的分离及S基因序列分析

本研究旨在从临床仔猪腹泻样品中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),并对其S基因进行测序分析.对腹泻仔猪小肠样品进行RT-PCR检测、病毒的分离培养、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定、S基因测序及遗传演化分析.结果显示:仔猪腹泻由流行性腹泻病毒引起;在Vero细胞上成功分离流行性腹泻病毒,命名为XP2018,该毒株细胞病变明...     

一株内源性猪细小病毒的分离与鉴定

本研究从不明病毒污染的ＰＫ１５细胞培养物中分离到了一株猪细小病毒,从形态学、血清学、分子生物学几个方面对其进行了鉴定,同时克隆了该毒株ＶＰ２基因,并测定了其核苷酸序列。将该毒株命名为ＳＹ－９９株。     

PRRSV重组M蛋白表达及胶体金试纸的制备

为建立PRRSV抗体的检测方法,通过扩增PRRSV ORF6基因,将其克隆至pET-28a（＋）中,IP TG诱导重组质粒转化菌表达,经SDS-P AGE和Western blot鉴定,表明重组质粒能够表达目的蛋白;经亲和层析纯化表达蛋白,以SP A标记胶体金,用纯化M融合蛋白和羊抗猪抗体为检测线和质控线研制胶体金试纸,检测猪血清样品,比较与IDEXX ELISA试剂盒检测结果的符合率。结果表明,表达蛋白具有良好的反应性,制备的胶体金试纸与IDEXX ELISA试剂盒检测符合率为89％,该方法为P RRSV抗体的检测提供了快速简便的方法。     

猪圆环病毒研究进展

近年来断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning muhisystemic wasting syndrome,PMWS)在全世界范围内呈不断流行和蔓延的趋势。猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2),目前已被世界各国学者确认为是引起PMWS的主要病原体,许多对PCV-2的研究也主要是针对PMWS的。本文就近年来对猪圆环病毒的病原及致病性、流性病学、诊断及防制等方面的研究进展作一综述。     

猪细小病毒血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清的制备与鉴定

猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）血凝抑制试验抗原、阳性血清和阴性血清在猪细小病毒制品的效力检验中不可或缺,对猪细小病毒相关生物制品的质量控制至关重要。试验采用PPV 7909株病毒同步接种PK-15细胞制备血凝抑制试验抗原,用制备的抗原乳化后免疫豚鼠制备阳性血清,同时用未免疫的阴性豚鼠制备阴性血清。对抗原、阳性血清和阴性血清进行鉴定,结果表明,制备的PPV血凝抑制试验抗原HA效价达1:512;阳性血清HI效价达1:1024;阴性血清HI效价＜1:8,且特异性均良好。利用制备的血凝抑制试验抗原、阳性血清与不同PPV疫苗株的灭活抗原、阳性血清进行交叉反应试验,结果表明,制备的抗原与阳性血清具备良好的血清学交叉反应性,可用于PPV制品的统一评价。     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺，提高PCV2疫苗生产效率，降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化，并在无血清悬浮培养体系下，采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响，同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养，且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1；悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代，连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动，且细胞活率始终>90%；以1.0×10⁶/mL接种，第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL，并可维持1 d，第4天前活率均>90%，此后快速下降；病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05，细胞接种密度为1.0×10⁶/mL，最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL；对细胞感染前后的代谢分析发现，病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前，且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累，之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于PCV2增殖，结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

猪德尔塔冠状病毒致病机理及防治研究进展

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,能引起猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业带来巨大威胁。深入开展PDCoV的研究对该病的防控有重要意义。PDCoV基因组编码的4种结构蛋白、15个非结构蛋白和3个辅助蛋白在病毒复制、增殖及致病过程中发挥重要作用。PDCoV致病机理复杂,笔者从其侵入宿主细胞以颉颃干扰素反应、诱导细胞凋亡、调控细胞自噬、抑制细胞焦亡途径来逃避宿主免疫应答,以及其他影响PDCoV复制的分子机制方面对其致病机理进行总结。PDCoV呈全球性流行趋势,常用S、M和N基因作为核酸检测和抗体检测靶标进行诊断。目前,尚未开发出针对PDCoV的安全有效的商品化疫苗和治疗方法,随着生物技术的发展,在灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、重组载体疫苗、病毒样颗粒疫苗和乳酸菌载体口服疫苗上取得一定进展,且广谱抗病毒药物、抗病毒分子蛋白和新型抗病毒技术在PDCoV抗病毒研究中显示了良好的应用前景。因此,笔者总结PDCoV编码蛋白功能、致病机理、诊断方法及PDCoV的疫苗开发和抗病毒治疗,以期为后续科学研究和有效防治提供借鉴。     

猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析

【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和Hind Ⅲ双酶切的线性化pET-32a (+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D_{600 nm}值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37 ℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度＞95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10⁴U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为研究2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场是否有猪流行性腹泻病毒的感染与流行,对猪流行性腹泻病毒ORF3(Open reading flame 3)基因进行克隆及序列分析研究。通过从疑似流行性腹泻病毒感染的猪场采集小肠组织,采用RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒的ORF3基因进行克隆。结果表明,所获得的ORF3基因ORF长675bp,编码223个氨基酸。通过DNAMAN软件分析,表明本研究中克隆的ORF3基因与CV777标准株(AF353511)的ORF3基因相似性为96.45%,与中国的NJ(KJ642645)的相似性最高,为99.41%,与attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%,而与CV777疫苗株(GU372744)相似性仅79.07%。系统进化树分析表明,该基因与中国毒株、韩国毒株以及美国分离株USA/Illinois 201/2014(KR265795)处于同一进化分支上,而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和欧洲的CV777标准株处于另一个进化分支上,说明该基因与中国毒株、韩国毒株的遗传距离最近。通过B细胞抗原表位预测分析,发现其氨基酸第65~68、114~116、137~140和150~154区域可能有潜在的优势抗原表位。成功克隆了猪流行性腹泻病毒ORF3基因,说明2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场存在猪流行性腹泻病毒的感染。     

长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

【目的】 试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru，PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用，以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】 根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1)，利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M)，并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型，在0、6、12、24、36和48 h收集细胞，利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达，以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，分别转染Vero-E6细胞，待细胞汇合度达到90%时接毒，感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况，筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后，通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平，以验证自噬的发生情况。【结果】 成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1，并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明，lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后，细胞皱缩、聚集成团，细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在1 326 bp处出现目的条带，说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中，Western blotting结果显示，6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h (P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示，LC3的mRNA表达量在48 h最高，且极显著高于0 h(P<0.01)，自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势，在48 h表达量最高，48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h (P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好，干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后，Western blotting结果显示，24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组，自噬受到抑制。【结论】 PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生，lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。